大肠埃希菌耐药质粒消除剂
 

大肠埃希菌是医学和兽医学临床感染中最常见的病原菌之一,又是耐药机制复杂、耐药产生迅速和传播广泛的典型人兽共患病病原。在兽医临床上,鸡的脐炎、关节炎、腹膜炎、输卵管炎、眼球炎、大肠埃希菌败血症及猪的黄白痢、仔猪水肿病、仔猪断奶期腹泻等疾病都与致病性大肠埃希菌有关。随着养殖业的迅速发展及抗生素的广泛应用,大肠埃希菌耐药性也越来越严重,并出现多重耐药株 ,成为医学和兽医学一大难题。另外,大肠埃希菌是一种人畜共患菌,很有可能把耐药基因通过畜产品以及环境等途径介导给人类,威胁人体健康。因此寻找一种有效的消除耐药性的方法,恢复大肠埃希菌对药物的敏感性,已经成为研究的热点。

1  动物源性大肠埃希菌耐药现状

随着抗菌药的不正当使用,大肠埃希菌不仅出现多重耐药株产生交叉耐药性,降低临床疗效,同时耐药产生的时间也越来越早,甚至有些新药刚研制成功,大肠埃希菌就具有了强大的抵抗力。赵春燕等报道的大肠埃希菌对氨苄青霉素的耐药率可达88 %以上,对庆大霉素耐药率> 75 % ,对头孢一代、二代的耐药率在40 %65 % ,对喹诺酮类药的耐药率也达55 %以上;张琳等[3 ] 2000 - 2002 年医院临床分离株的耐药性分析,得出大肠埃希菌对哌拉西林等头孢类耐药率逐年上升,耐药率甚至翻了,原因与医院临床用药不规范及细菌自身适应性相关。胡晓明等从分离的399 株菌中检测,大肠埃希菌对常用抗生素大部分耐药,耐药率最低的为阿米卡星(27. 9 %) ,进一步证明耐药的严重性。大肠埃希菌在20 世纪50 年代几乎未见耐药性相关报道,20 世纪60 年代报道分离株对大环内脂类、四环素类产生了耐药性,20 世纪70 年代有了对氨苄西林、氯霉素类、磺胺类等产生了耐药性的报道,20世纪80 年代至90 年代初报道对头孢类、氨基糖苷类、喹诺酮类和头孢噻酚等产生了耐药性。耐药性产生的速度也是越来越快,耐药机制也越来越复杂,严重影响临床治疗效果,对人类健康也带来巨大的威胁。因此,相关部门应该加强耐药性的监测,为临床合理用药提供依据,延缓耐药菌的产生和蔓延。

 大肠埃希菌耐药质粒

质粒是细菌内染色体外具有独立复制能力的小型共价闭合环状双链DNA 分子,可通过接合、转化、转导等方式与其他质粒或染色体进行高频率的转移、重组和复制,使敏感株获得耐药质粒变成耐药株,迅速广泛传播耐药性。细菌质粒包括抗性质粒、致育因子、Col 质粒、侵入性质粒和降解性质粒等,其中抗性质粒又称为质粒。质粒上携带着的抗性基因赋予了细菌对某些抗生素的耐药,广泛存在于革兰氏阳性和阴性菌中,几乎所有致病菌均可查到耐药质粒,且不同来源的致病性菌可以通过R质粒的介导而获得相同的耐药性,从而获得相同的耐药谱,造成抗生素和抗菌药在人医临床上的疗效降低或无效。对大肠埃希菌耐药质粒的报道有很多,如黄加权等[报道,4. 4 kb 质粒与链霉素耐药有关,23. 8 kb 质粒可能携带多种耐药基因,5. 5 kb 质粒可能为编码β2内酰胺酶的耐药质粒。耐药质粒与染色体突变不同,质粒消除后其耐药性不可回复,除非外源质粒再次转入 。耐药质粒可自宿主细胞内自发消除,但消除很缓慢,频率为10 - 2 10 - 8 。利用一些物理、化学等方法,抑制质粒的复制,使宿主细胞质粒丢失,其消除率比自发消除增加100 倍~100 000  。正因为这些特性,所以采取合适的方法来干扰质粒复制、或降低质粒的稳定性,人为地把质粒从宿主细胞内消除,来达到消除耐药质粒的方法是可行的。同时也可以利用这一特性,通过质粒图谱的缺失来鉴别质粒是否已被消除。

 大肠埃希菌耐药质粒消除方法

细菌耐药现象在全球范围内不可遏制地蔓延着,人们正在千方百计地从不同途径寻求克服细菌耐药的方法。从目前情况看,如果单纯依靠开发新的抗生素,或在原有药物基础上进行结构改造等手段来抑制细菌耐药性的产生,已经完全跟不上细菌耐药产生的速度。近30 年来,国内外的一些研究者积极寻找一些有效的方法去消除大肠埃希菌耐药质粒,以逆转其耐药性。

3. 1  化学法消除质粒

3. 1. 1  十二烷基磺酸钠 十二烷基磺酸钠( SDS)是一种阴离子表面活性剂,在合适的浓度下它能溶解细菌的内膜蛋白,破坏细胞膜,从而改变质粒在细胞膜上的结合位点,使其不能精确复制,达到消除质粒的目的。

3. 1. 2  嵌合染料及其他 嵌合染料包括吖啶黄(acriflvaine) 、吖啶橙(acridine orange ,AO) 、溴化乙锭(ethidium bromide ,EB) ,其作用机理是选择性地抑制质粒的复制。

3. 2  物理法消除质粒

利用质粒DNA 分子可以通过高温、高热、紫外照射等物理方法进行裂解,变性后的DNA 分子失去其功能的原理,可以来清除了细菌质粒及其携带的耐药性。但这些方法消除效果不是很明显,一般都是与其他化学消除剂联合使用。另外Huang BW  使用电穿孔法,对大肠埃希菌耐药质粒消除率可达80 % ,其原理是利用细菌处于电场中,膜内外电压差而使质粒得到消除。

3. 3  药物法清除质粒

一些抗生素在高浓度时起抗菌作用,在亚抑菌浓度时有质粒消除作用。目前,研究较多的是氟喹诺酮类、头孢类、吩噻嗪类等药物的质粒消除作用。

3. 3. 1  氟喹诺酮类 氟喹诺酮类药物通过抑制DNA 旋转酶亚单位的活性,影响DNA 的复制,达到快速抗菌作用。黄瑞等 研究发现在亚抑菌浓度下与中药联用,可以消除质粒,且不会诱导耐药突变株,甚至还可能加强受试菌对其他化疗剂的敏感性。

3. 3. 2  头孢类 头孢类药物为广谱抗生素,在发生杀菌作用的同时,也可部分地消除其他细菌的耐药质粒。高枫等在用头孢拉定胶囊对急性菌痢病人治疗时,发现患者用药后体内大肠埃希菌耐药率均比用药前有所降低,差异显著;同时耐药性质粒的区带亦有显著减少。

3. 3. 3  吩噻嗪类 吩噻嗪类药物单独使用,质粒清除率很低,但是在质子泵抑制剂存在的基础上,可大大的加大其作用。如Gabriella S [ 14 ] 报道92氨吖啶和其它两种吩噻嗪类的药物在质子泵抑制剂协同下,大大的加强对大肠埃希菌耐药质粒消除效果。另外,Wolfart K [15 ] 报道三氟甲噻嗪还可通过增强大肠埃希菌质子泵抑制剂作用,从而使钙调素颉颃剂———异丙嗪对质粒消除的作用。

3. 3. 4  其他药物 具有一定化学环性结构的非诱导的杂环化合物,能够特异性的结合质粒的DNA分子,抑制其螺旋酶作用,从而抑制复制,消除大肠埃希菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌等质粒介导的耐药性 。如Shriram V  报道经过现代化学分析确定的一种新化合物EEA 能有效的消除介导多重耐药基因的质粒,对大肠埃希菌的消除率可达到12 %48 %

3. 4  中药对质粒的消除

目前已用于细菌耐药质粒消除的中药种类繁多,主要以清热解毒、清热燥湿类药物为主,如苍术、金银花、黄芩、黄连、黄柏、千里光、马齿苋、射干、鱼腥草、大蒜油、艾叶油等,以及相关的复方制剂,如止痢灵、三黄片等。自20 世纪80 年代至今,对中药消除耐药质粒的相关研究报道连续不断。虽然消除率报道不一,存在较大的差异,但由于其天然环保,毒副作用小,价格便宜及体内应用安全等优点,还是受到了广大研究者的重视。

3. 4. 1  中药直接消除质粒特点 随着科学技术的进步,应用灵敏度高的PCR 法来特异性的进行判断质粒是否被消除,大大的提高了中药消除剂效果的准确率。中药消除质粒具有特殊的表型特点,首先,同一菌株的质粒对不同中药消除剂敏感性不同,同种中药对不同的菌株、同种中药不同有效成分对耐药质粒消除效果也不同 ;如对同种大肠埃希菌的耐庆大霉素质粒,鞠洪涛等 报道黄连消除率小于0. 05 % ,艾叶乙醇提取物的消除率最高可达69. 4 %,康梅等 研究也表明中药复方三黄片对大肠埃希菌耐药质粒的消除率为31 % ,比其他报道的黄连单味药的消除率要高很多。这可能与中药复方采用“君臣佐使”的原理,使用性能功效相似的同类药物起到协同、作用相关。另外,中药体外消除效果不如体内消除效果,可能是在体内细菌不仅受到药物的作用,同时受到机体的内环境,特别是免疫因素的影响 。最后,中药对非结合传递耐药质粒( r 质粒的消除率明显高于接合传递耐药质粒(R 质粒) ,这可能因为质粒分子质量小,多半为松弛型质粒,拷贝数目多,非传递性,在药物作用下容易丢失 

3. 4. 2  中药通过抑制外排泵作用来消除质粒 一些中药有效成分可以通过抑制细菌外排泵作用来消除细菌的耐药性,如罗音久研究发现,紫花地丁提取物通过抑制大肠埃希菌对环丙沙星泵出,使耐药株的MIC 可降至25 %50 %不等。雷连成等 发现,黄连提取物还可通过抑制细菌外排泵作用、恢复外膜通道蛋白表达来抑制细菌耐药质粒作用。

应用

我公司专家教授按照中药消除耐药性的机理,再应用现代中药提取、分析、精制技术,开发出纯天然高活性中药质粒消除剂“穿肠康,消除质粒耐药性达80%以上,提高抗生素疗效达2-3倍,引领了中西药防治细菌性疾病的方向,对降低药残,进行绿色养殖,扩大出口,提高肉、蛋、奶质量,提高疾病防治水平等具有重要意义,具有广阔应用前京。

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如罗音久研究发现,紫花地丁提取物通过抑制大肠埃希菌对环丙沙星泵出,使耐药株的MIC 可降至25 %50 %不等。雷连成等 发现,黄连提取物还可通过抑制细菌外排泵作用、恢复外膜通道蛋白表达来抑制细菌耐药质粒作用。

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